Adrian Rogers, Senior Research Scientist, Romer Labs

In diesem ersten Teil einer Serie diskutiert Adrian Rogers die Grundlagen der Allergenanalyse in Lebensmitteln – von der Auswahl des richtigen Testkits bis zu Methoden zur präzisen Validierung.

Als ich mit der Entwicklung von Immunassays zum Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln begonnen habe, war das Erste, was mir auffiel, die enorme Vielfalt an verschiedenen Lebensmitteltypen oder matrices, mit denen die Assays arbeiten mussten. Aus einem Bereich für medizinische Immunassays kommend, gab es für mich bis dahin nur eine begrenzte Anzahl an verschiedenen Matrizes, mit denen man zu arbeiten hatte. In meinem Fall war es Blutserum. Bei Lebensmitteln haben wir es aber mit einer nahezu unendlichen Auswahl an unterschiedlichen Proben zu tun, von denen jede wiederum ihre eigenen spezifischen Eigenschaften besitzt.

Wie wähle ich das richtige Testsystem aus?
Wie können wir also sicherstellen, dass der hergestellte Testkit für die Verwendung mit so vielen verschiedenen und schwierigen Matrizes geeignet ist? An diesem Punkt kommt die Probenvalidierung ins Spiel. Dieser Vorgang besteht darin, eine bekannte Menge des gesuchten Allergens zur gewünschten Matrix zuzugeben (Dotierung) und dann zu untersuchen, wie viel man von diesem Allergen wieder heraus bekommt (Wiederfindung). Dabei ist es wichtig, dass Immunassays – wie der Name schon sagt – biologische Komponenten (Antikörper) besitzen, die notwendig sind, um das allergene Protein zu detektieren. Wie alle biologischen Systeme, reagieren dadurch auch diese Testkits äußerst empfindlich auf variierende Umweltbedingungen. Im Fall von Lebensmitteln funktioniert der Kit in Anwesenheit von stark sauren oder basischen pH-Werten und hohem Salz- oder Fettgehalt möglicherweise nicht mehr so, wie er soll. Viele dieser extremen Bedingungen können während des Extraktionsprozesses entschärft werden. Die Kits verwenden dafür ein gepuffertes System, um einerseits mit den Veränderungen des pH-Werts zurecht zu kommen und andererseits hilft die Zugabe von Puff er auch dabei andere Probleme, wie einen hohen Salz- und Fettgehalt durch Verdünnung zu reduzieren.

Ist meine Wiederfindung akzeptabel?
Welcher Wert ist also in Bezug auf die Wiederfindung einer bekannten Menge des Allergens in der Probenmatrix akzeptabel? Um diese Frage beantworten zu können, müssen wir zuerst die Ausgangslage definieren. Ist es eine dotierte Probe, oder handelt es sich um eine prozessierte?

Prozessierte Proben sind Proben, bei denen eine definierte Menge des Allergens am Beginndes Produktionsprozesses zugegebenwurde, um so gutwie möglich die realen Bedingungen zu imitieren, unter denen das Lebensmittel üblicherweise erzeugt wird.

Auf das Thema der prozessierten Proben wird in späteren Ausgaben von Spot On noch weiter eingegangen. In diesem Artikel werde ich mich auf die einfacher auszuführende Methode des Dotierens konzentrieren, bei der eine genau bekannte Menge des Allergens in eine Probe eingebracht wird, um anschließend die Wiederfindung zu messen (siehe Literaturhinweis).

In Bezug auf die Wiederfindung, gibt die erwähnte AOAC-Richtlinie an, „dass die Wiederfindung idealerweise zwischen 80 % und 120 % liegt. Die Wiederfindung wird dabei sowohl von der Effizienz des Extraktionsschrittes, als auch von der ELISA Prozedur beeinflusst.“„Bei ELISA-Methoden für Lebensmittelallergene ist dieser Wert für die Wiederfindung nicht immer möglich, vor allem dann, wenn besonders schwierige Matrizes analysiert werden. Zudem kann sich die Wiederfindung bei prozessierten Proben und dotierten Proben signifikant unterscheiden. Aus diesem Grund werden alle Wiederfindungswerte zwischen 50 % und 150 % als akzeptabel angesehen, solange sie immer gleichbleibend sind.“

Die Richtlinie wurde 2010 von der Association of Analytical Communities (AOAC) veröffentlicht, wobei im Speziellen auf quantitative ELISA Methoden Bezug genommen wurde. Viele der Schlüsselelemente dieser Publikation sind auch auf qualitative oder semiquantitative Streifentests übertragbar.

Der wissenschaftliche Hintergrund der Dotierung
Wenn wir es mit einem neuen Lebensmittel zu tun bekommen, das zuvor noch nicht getestet wurde, werden üblicherweise zunächst Dotierungsversuche unternommen um sicherzustellen, dass dieses Lebensmittel auch wie gewünscht mit unseren Testkits funktioniert. Das Lebensmittel wird dazu mit drei unterschiedlichen Konzentrationen des Allergens dotiert – niedrig, mittel und hoch – um die gesamte Bandbreite des Detektionsbereichs des Testkits abzudecken.

Die Konzentration der niedrigsten Allergendotierung befindet sich nahe der unteren Quantifizierungsgrenze (Lower Limit of Quantification, LLOQ) des ELISAs (in diesem Fall nahe der Konzentration des niedrigsten Standards nach 0 ppm) oder knapp oberhalb der Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) eines Streifentests. Die mittlere Dotierung wird im mittleren Bereich der Kalibrationskurve des ELISAs angesetzt und die höchste Dotierung befindet sich nahe der oberen Quantifi zierungsgrenze (Upper Limit of Quantification, ULOQ), die der Konzentration des höchsten Standards entspricht. Die Lebensmittelprobe wird anschließend genauso extrahiert und getestet, wie es in der Arbeitsanleitung des Testkits beschrieben ist.

Würden wir also beispielsweise eine Schokolade mit 5 ppm Mandeln dotieren, dann würden wir eine Wiederfindung von 4 – 6 ppm erwarten. Falls das Ergebnis außerhalb dieses Bereichs liegt, gibt es noch die Möglichkeit weitere Maßnahmen zu ergreifen, um die Wiederfindung zu verbessern. Der Erfahrung nach stellt die Analyse von Schokolade eine der größten Herausforderungen bei Allergentests dar ‒ sie beinhaltet viele Tannine und andere Polyphenole, die an die Allergene binden können. Dadurch entstehen unlösliche Proteinkomplexe, die sehr schwierig zu extrahieren sind.

Solche Problematiken können durch die Zugabe von zusätzlichen Proteinen zum Extraktionspuffer gelöst werden. Die überschüssigen Proteine binden an die Polyphenole und verhindern so die Komplexbildung mit Allergenen, die dadurch besser zugänglich für die Extraktion sind. Mein Protein der Wahl ist Fischgelatine, obwohl auch andere Materialien, wie Milchpulver verwendet werden können, um die Extraktionseffizienz bei Lebensmitteln mit hohem Polyphenolgehalt zu verbessern. Falls die Verwendung von Milchpulver bevorzugt wird, sollte streng darauf geachtet werden, die Laborräumlichkeiten nicht zu kontaminieren, vor allem dann, wenn Milchallergene untersucht werden sollen. Lateral Flow Systeme (LFD), oft auch Streifentests genannt, können auf ähnliche Weise wie der ELISA bezüglich der Wiederfindung validiert werden. Das einzige, was aber unbedingt zu beachten ist, ist dass man den Streifentest mit der Wahl der höchsten Allergen-Dotierung auch überladen kann. Auch wenn LFDs grundsätzlich in der Lage sind sehr hohe ppm-Werte an Allergen zu detektieren, so ist es trotzdem möglich, dass dieser Effekt schon bei einem Allergengehalt von über 1 % auftritt.

Erhaltung der Qualität und Präzision des Tests
Es kann für einen Testhersteller notwendig sein, sehr eng mit Kunden zusammenzuarbeiten, die routinemäßig anspruchsvolle Lebensmittel untersuchen wollen. Es ist wichtig zu bestätigen, dass der Test so funktioniert wie er sollte und den Ansprüchen des Kunden entspricht. Wie oben bereits beschrieben, kann dies durch Dotierungsexperimente zur Bestimmung der Wiederfindung in problematischen Matrizes erreicht werden. In manchen Fällen ist es von Vorteil die Standard-Testmethode zu ändern oder zu modifizieren, um den Anforderungen der Probe und/oder des Kunden zu genügen. Dies sollte aber immer unter der Anleitung des Testherstellers erfolgen, um die Qualität und Reproduzierbarkeit der Testergebnisse sicherzustellen.

Literaturhinweis:
Validation Procedures for Quantitative
Allergen ELISA Methods:
Community Guidance and Best Practices,
Abbot et al, Journal of AOAC International
Vol 93, No 2, 2010

Kontakt:
Romer Labs Deutschland GmbH
E-Mail: germany@romerlabs.com
www.romerlabs.com

Ausgabe September/Oktober 2018 „Der Lebensmittelbrief/ernährung aktuell”