– von der Auswahl des richtigen Testkits bis zu Methoden zur präzisen Validierung

Adrian Rogers, Senior Research Scientist, Romer Labs

Die Vielfalt verschiedener Matrices, mit denen Immunassays beim Nachweis von Allergenen funktionieren müssen, ist bekanntlich sehr groß. Vor allem bei Lebensmitteln existieren nahezu unbegrenzte Variationsmöglichkeiten unterschiedlicher Matrices, von denen wiederum jede ihre eigenen spezifischen Eigenschaften besitzt. Angesichts der vielen Kombinationsmöglichkeiten von Assays und Matrices stellt sich die Frage, wie man es schaffen kann, ein Testsystem zu entwickeln, das an die eigenen Anforderungen angepasst ist und die Qualität der Endprodukte sichert.

Wie wähle ich das richtige Testsystem aus?
Wie kann sichergestellt werden, dass der hergestellte Testkit für die Verwendung mit so vielen verschiedenen und schwierigen Matrizes geeignet ist? An diesem Punkt kommt die Probenvalidierung ins Spiel. Hierbei wird eine bekannte Menge des gesuchten Allergens zur gewünschten Matrix zugegeben (Dotierung) und dann untersucht, wie viel von dem gesuchten Allergen in dieser Matrix wiedergefunden wird (Wiederfindung). Dabei ist es wichtig, dass Immunassays – wie der Name schon sagt – biologische Komponenten (Antikörper) enthalten, die notwendig sind, um das allergene Protein zu detektieren. Wie alle biologischen Systeme reagieren deshalb auch diese Testkits äußerst empfindlich auf variierende Umweltbedingungen. Im Fall von Lebensmitteln funktioniert der Testkit z.B. in Anwesenheit von stark sauren oder basischen pH-Werten und hohem Salz- oder Fettgehalten möglicherweise nicht mehr so, wie er soll. Viele dieser Bedingungen können aber während des Extraktionsprozesses eliminiert werden. Die Testkits verwenden dafür gepufferte Systeme, um einerseits pH-Werte zu puffern und andererseits durch Volumenzugabe andere Probleme, wie zu hohe Salz- und Fettgehalte, durch Verdünnung zu reduzieren.

Ist meine Wiederfindung akzeptabel?
Welcher Wert ist also in Bezug auf die Wiederfindung einer bekannten Menge des Allergens in der Probenmatrix akzeptabel? Um diese Frage zu beantworten, muss zuerst die Ausgangslage definiert werden. Ist es eine dotierte Probe, oder handelt es sich um eine prozessierte? Prozessierte Proben sind Proben, bei denen eine definierte Menge des Allergens am Beginn des Produktionsprozesses zugegeben wird. Dabei sollen die realen Bedingungen imitiert werden, unter denen das Lebensmittel üblicherweise erzeugt wird. Obwohl das Thema der prozessierten Proben sehr wichtig ist, wird an dieser Stelle auf die einfachere auszuführende Methode des Dotierens eingegangen. Ziel dieser Methode ist es, eine genau bekannte Menge des Allergens in eine Probe einzubringen, um anschließend die Wiederfindungsrate zu bestimmen.

In Bezug auf die Wiederfindung gibt eine anerkannte AOAC-Richtlinie 1 an, „dass die Wiederfindung idealerweise zwischen 80 % und 120 % liegt. Die Wiederfindung wird dabei sowohl von der Effizienz des Extraktionsschrittes, als auch von der ELISA Prozedur beeinflusst.“ „Bei ELISA-Methoden für Lebensmittelallergene ist die Bestimmung der Wiederfindung nicht immer möglich, vor allem dann, wenn besonders schwierige Matrizes analysiert werden. Zudem kann sich die Wiederfindung bei prozessierten Proben und dotierten Proben signifikant unterscheiden. Aus diesem Grund werden alle Wiederfindungswerte zwischen 50 % und 150 % als akzeptabel angesehen, solange sie immer gleichbleibend sind.“

Die Richtlinie wurde 2010 von der Association of Analytical Communities (AOAC) veröffentlicht, wobei im Speziellen auf quantitative ELISA-Methoden Bezug genommen wurde.Viele der Schlüsselelemente dieser Publikation sind auch auf qualitative oder semi-quantitative Streifentests übertragbar.

Der wissenschaftliche Hintergrund der Dotierung
Wenn es um ein neues Lebensmittel geht, daszuvor noch nicht getestet wurde, werden üblicherweise zunächst Dotierungsversuche durchgeführt um icherzustellen, dass dieses Lebensmittel auch wie gewünscht mit dem jeweiligen Testkit funktioniert. Das Lebensmittel wird dazu mit drei unterschiedlichen Konzentrationen des Allergens dotiert – niedrig, mittel und hoch – um die gesamte Bandbreite des Detektionsbereichs abzudecken. Die Konzentration der niedrigsten Allergendotierung befindet sich nahe der unteren Quantifizierungsgrenze (Lower Limit of Quantification, LLOQ) des ELISAs (in diesem Fall nahe der Konzentration des niedrigsten Standards nach dem Nullstandard) oder knapp oberhalb der Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) eines Streifentests. Die mittlere Dotierung wird im mittleren Bereich der Kalibrationskurve des ELISAs angesetzt und die höchste Dotierung nahe der oberen Quantifizierungsgrenze (Upper Limit of Quantification, ULOQ), die der Konzentration des höchsten Standards entspricht. Die dotierten Lebensmittelproben werden anschließend entsprechend der Arbeitsanleitung extrahiert und getestet.

Würde man beispielsweise eine Schokolade mit 5 ppm Mandeln dotieren, dann wäre eine Wiederfindung von 4 – 6 ppm wünschenswert. Falls das Ergebnis ußerhalb dieses Bereichs liegt, können weitere Maßnahmen ergriffen werden, um die Wiederfindungsrate zu verbessern. Das Beispiel von Schokolade stellt eine der größten Herausforderungen für die Allergenanalysen dar. Schokolade beinhaltet viele Tannine und andere Polyphenole, die sich an die Allergene binden können. Dadurch entstehen oft unlösliche Proteinkomplexe, die sehr schwierig zu extrahieren sind.

Solche Probleme können teilweise einfach durch die Zugabe von unspezifischen Proteinen zum Extraktionspuffer gelöst werden. Anstelle der Allergenproteine reagieren die hinzugefügten Proteine mit den Polyphenolen. So wird die Komplexbildung mit den Allergenen vermindert, die dadurch besser für die Extraktion zugänglich sind. Als besonders effizientes Protein hat sich Fischgelatine erwiesen, obwohl auch andere Materialien wie Milchpulver verwendet werden können, um die Extraktionseffizienz bei Lebensmitteln mit hohem Polyphenolgehalt zu verbessern. Falls die Verwendung von Milchpulver bevorzugt wird, ist streng darauf zu achten, dass die Laborräumlichkeiten nicht kontaminiert werden, vor allem dann, wenn auch Milchallergene untersucht werden. Lateral Flow Systeme (LFD), oft auch Streifentests genannt, können auf die gleiche Art wie der ELISA hinsichtlich der Wiederfindung validiert werden. Hierbei ist zu beachten, dass man den Streifentest bei der Wahl der höchsten Allergen-Dotierung überladen kann (Hook-Effekt). Auch wenn LFDs grundsätzlich in der Lage sind, sehr hohe ppm- Werte an Allergen zu detektieren, so ist es trotzdem möglich, dass dieser Effekt schon bei einem Allergengehalt von über 1 % auftritt.

Erhaltung der Qualität und Präzision des Tests Es kann für einen Testhersteller notwendig sein, sehr eng mit Kunden zusammenzuarbeiten, die routinemäßig anspruchsvolle Lebensmittel untersuchen. Eine Validierung der Testsysteme ist wichtig, um zu bestätigen, dass der Test den Ansprüchen des Kunden entspricht. Wie oben bereits beschrieben, kann dies durch einfache Dotierungsexperimente zur Bestimmung der Wiederfindung in allen Matrices erreicht werden. Es kann von Vorteil und notwendig sein, die Standard-Testmethode zu ändern oder zu modifizieren, um den Anforderungen der Probe und/oder des Kunden gerecht zu werden. Dies sollte aber immer in Abstimmung mit dem Testhersteller erfolgen, um die Qualität und Reproduzierbarkeit der Testergebnisse zu gewährleisten.

1 Validation Procedures for Quantitative Allergen ELISA Methods: Community Guidance and Best Practices, Abbot et al, Journal of AOAC International Vol 93, No 2, 2010.

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Ausgabe Januar/Februar 2018 „Der Lebensmittelbrief/ernährung aktuell”