Von Kurt Brunner, DI Dr., Division Research Officer, Romer Labs®

ELISA, Teststreifen, PCR oder Massenspektrometrie – gibt es die perfekte Testmethode für Allergene? Kurt Brunner diskutiert die Vor- und Nachteile der verschiedenen Möglichkeiten. Die meisten kommerziell erhältlichen Testkits für Lebensmittelallergene beruhen auf der Verwendung von immun-basierten Methoden, wie ELISA oder Lateral Flow Systemen (Teststreifen). Um einen ELISA durchzuführen, wird zwar geschultes Personal benötigt, aber durch die Verwendung von 48-Well oder 96-Well Mikrotiter-Platten können zahlreiche Proben gleichzeitig analysiert werden. Im Allgemeinen kann so eine Analyse zwischen 30 Minuten und einigen Stunden dauern. Derzeit ist der ELISA die am weitesten verbreitete Methode für die Detektion und Quantifizierung von Lebensmittelallergenen. Jedoch kann man, obwohl viele Proben gleichzeitig analysiert werden können, die Proben jeweils nur auf ein bestimmtes Allergen testen.

Zu beachtende Limitierungen

Aufgrund der hohen Spezifität eines Antikörpers gegenüber nur einem bestimmten allergenen Protein und weiteren Limitierungen bedingt durch die Technologie, muss für jedes Allergen ein separates Testsystem verwendet werden. Zudem kann der hohe Grad an Spezifität gegenüber einem Allergen auch zu falsch negativen Ergebnissen führen. Lebensmittelverarbeitungsschritte, wie Hitzebehandlung, der Zusatz saurer Verbindungen oder Fermentation können die Struktur des Zielproteins verändern. Diese modifizierten Allergene können ihre immunologischen Eigenschaften verlieren und der Antikörper-Protein-Komplex kann nicht mehr gebildet werden. Das führt zu falsch negativen Resultaten oder zu niedrigen Messergebnissen. Streifentests sind kostengünstig, sehr einfach in der Anwendung, benötigen keine Laborgeräte und zeigen das Ergebnis üblicherweise innerhalb weniger Minuten an. Allerdings sind die meisten Streifentests nur qualitativ und sind ebenfalls auf Antikörper als Detektionselemente angewiesen. Aus diesem Grund haben sie bei hoch prozessierten Lebensmitteln mit denselben Problemen zu kämpfen wie ELISA-Tests. In den letzten Jahren wurden alternative Analysenmethoden entwickelt, um zumindest ein paar der Einschränkungen von Immunbasierten Testsystemen zu umgehen.

Allergendetektion mittels PCR

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine relativ schnelle und günstige Methode zur Identifizierung von DNA. Die Technologie hat sich seit ihrer Entwicklung in den 1980er Jahren stetig verbessert. Inzwischen wird die PCR seit vielen Jahren in den Bereichen der medizinischen Diagnostik, Forensik und Umweltüberwachung und zur Quantifizierung genetisch veränderter Organismen in Lebens- und Futtermitteln verwendet. In den frühen 2000er Jahren wurde die PCR zum ersten Mal eingesetzt, um die DNA sehr bekannter Lebensmittelallergene, wie Haselnüsse oder Erdnüsse, zu identifizieren. Bis zum heutigen Tag wurden PCR Testmethoden für die meisten der „Big Eight“ Allergene in den USA und der 14 kennzeichnungspflichtigen Allergene in der EU veröffentlicht.

Bei der PCR werden kleine Fragmente einer Ziel-DNA so lange vervielfältigt, bis eine ausreichende Anzahl an Kopien für die Visualisierung oder Quantifizierung vorhanden ist. Das Zielfragment der Analyse wird dabei um den Faktor 107 bis 109 vervielfacht, sodass die wenigen Moleküle der Ziel-DNA in ausreichender Menge vorhanden sind, um allergene Inhaltsstoffe erfolgreich zu detektieren. Ursprünglich wurde die PCR als qualitative Methode entwickelt, aber später wurde sie so modifiziert, dass nun mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen oder speziellen Sonden auch eine quantitative Analyse möglich ist. Die Tatsache, dass die PCR das extrem stabile DNA-Molekül detektiert, kann für die Analyse von hoch prozessierten Lebensmitteln ein Vorteil sein. DNA verändert sich meist auch unter extremen Bedingungen nicht und kann daher immer noch nachgewiesen werden, wenn die meisten Proteine schon abgebaut oder verändert wurden. Außerdem kann die PCR für Allergene wie Sellerie verwendet werden, die nicht durch Antikörper detektiert werden können.

Während der letzten Jahre wurden auch neuere DNA-Detektionsmethoden entwickelt. Alle diese sogenannten isothermalen Amplifikationstechniken sind bis zu einem gewissen Grad mit der konventionellen PCR verwandt, können aber mit minimaler Geräteausstattung durchgeführt werden.

Massenspektrometrie: eine High-End Technologie

Eine noch neuere Technologie für den Nachweis und die Quantifizierung von Allergenen ist die Massenspektrometrie – eine High-Tech Methode, die Proteine und Peptide mit großer Genauigkeit identifizieren kann. Die ersten Versuche diese Technologie für die Detektion von Allergenen einzusetzen begannen schon in den späten 1990er Jahren, aber die meisten Ergebnisse wurden erst in den letzten Jahren veröffentlicht.

Der größte Vorteil dieser Technologie für die die Lebensmittelanalyse ist der hohe Grad an Zuverlässigkeit. Die Geräte sind in der Lage, mehrere Peptide pro Protein zu detektieren. Idealerweise werden zwei bis drei Peptide pro Allergen analysiert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass die Wahrscheinlichkeit zumindest ein intaktes Fragment zu finden sehr hoch ist, auch wenn die Proteine durch die harschen Bedingungen während der Lebensmittelverarbeitung teilweise abgebaut oder verändert wurden. Solche Marker-Peptide werden aus Datenbanken oder Literaturquellen ausgewählt und müssen höchst spezifisch für das zu quantifizierende Allergen sein. Außerdem wird bei der Auswahl dieser Peptide auch darauf geachtet, dass sie möglichst widerstandsfähig in Bezug auf Verarbeitungsprozesse sind.

Die Massenspektrometrie ist auch in der Lage mehrere Allergene gleichzeitig zu analysieren. Diese Multi-Analyt Methoden sind vor allem in den letzten Jahren sehr beliebt geworden. Die innovative Strategie ermöglicht die Analyse mehrerer Allergene aus einem einzigen Probenextrakt in nur einem Analysendurchgang. Die Extraktionsprozedur ist für die Massenspektrometrie wesentlich aufwendiger als für andere Testmethoden. Auch wenn die Aufbereitungsschritte sehr zeitaufwendig sind, so kann die erhaltene Peptidlösung mit Hilfe des Massenspektrometers auf mehrere Allergene gleichzeitig untersucht werden.

Aktuell können solche Multi-Methoden bis zu sieben Allergene parallel quantifizieren, aber es ist zu erwarten, dass diese Zahl in den nächsten Jahren möglicherweise drastisch steigen wird. Mycotoxin Multi-Analysenmethoden starteten vor etwa zehn Jahren mit nur wenigen Analyten. Heute ist die fortschrittlichste Methode in der Lage mehr als 400 Toxine in einem Durchlauf zu analysieren.

Keine „Eine-für-Alles“ Lösung

Die perfekte Methode als Goldstandard für die Allergenquantifizierung gibt es nicht. ELISA und Teststreifen sind die Methoden der Wahl für einen Großteil der industriellen Anwendungen. Man erhält sehr schnell Ergebnisse, die Kosten sind relativ niedrig und die Schulung des Personals ist einfach. Bei manchen Proben, wie hochprozessiertes Testmaterial oder sehr spezifische Analyten, kann die PCR bessere Resultate erzielen. Die Massenspektrometrie ist am oberen Ende der derzeit möglichen Technologien angesiedelt, steckt aber in Bezug auf Allergentests noch immer in den Kinderschuhen. Sie wurde dennoch in den letzten Jahren für viele analytischen Herausforderungen zur Methode der Wahl. Es ist somit zu erwarten, dass diese Technologie in der näheren Zukunft einen weiteren Aufschwung im Gebiet der Allergenanalytik erfahren wird.

Ausgabe Juli/August 2019 „Der Lebensmittelbrief/ernährung aktuell”